头颈鳞癌是一种侵袭性的恶性肿瘤，通常在晚期诊断，具有快速复发和转移的倾向，往往导致患者预后不良[1]。尽管其治疗方式取得了一定进展，包括精确放疗、精细手术技术和新型化疗药物，头颈鳞癌的死亡率仍高达40%～50%[2-3]。面对这些临床上的挑战，迫切需要阐明头颈鳞癌的潜在分子机制并制定创新的治疗策略。细胞死亡调控是肿瘤治疗的核心研究方向之一[4]。铁自噬作为铁死亡与自噬交叉的新型细胞生理调控方式，区别于传统的细胞凋亡、坏死及焦亡，其核心是通过自噬相关通路特异性降解铁代谢相关蛋白，调控细胞内铁离子稳态与脂质过氧化水平，进而介导细胞程序性死亡[5-6]。已有研究证实，铁自噬异常激活与肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤细胞中铁自噬通路的沉默会导致铁离子代谢紊乱、抗氧化能力增强，进而促进肿瘤增殖与治疗抵抗[7]；而靶向诱导肿瘤细胞铁自噬发生，可有效抑制多种肿瘤的体内外生长，提示铁自噬是肿瘤治疗的潜在有效靶点[8]。

来源于中药的活性成分因其良好的生物相容性、高效性和较少的不良反应而受到越来越多的关注[9-10]。这些生物活性化合物在多种癌症类型中显示出抗肿瘤潜力[11-15]。穿心莲内酯是一种从穿心莲Andrographis paniculata(Burm. f.) Wall. ex Nees中分离的天然二萜内酯，在体内外均具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤活性[16-17]。然而，穿心莲内酯在头颈鳞癌中的抗肿瘤作用及机制目前尚不清楚。本研究首先通过体内外实验验证穿心莲内酯抗头颈鳞癌的活性，再借助脂质组学技术联合京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析筛选其作用的关键代谢通路，进而聚焦铁自噬通路，验证穿心莲内酯对铁自噬相关蛋白的调控作用，旨在从铁自噬角度揭示穿心莲内酯抗头颈鳞癌的潜在分子机制，同时也为中药靶向铁自噬治疗肿瘤提供新的研究思路与方向。

1 材料

1.1 动物

1.2 细胞

1.3 药品与试剂

1.4仪器

3111型CO2细胞孵育箱、Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；IX73型倒置显微镜（日本Olympus公司）；ImageQuant 800型化学发光凝胶成像系统（英国Amersham公司）；JY600C型Western blot电泳仪、JY-ZY5型Western blot电转仪（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 体外实验

2.1.1细胞培养CAL27细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，细胞生长密度达到70%～80%时，进行传代处理，取对数生长期的CAL27细胞用于后续实验。

2.1.2CCK-8实验检测细胞活力取对数生长期的CAL27细胞以4×104个/mL接种于96孔板中，每孔100μL，细胞贴壁后分别加入不同浓度（0、10、20、30、40、50、60、70、80、100μmol/L）的穿心莲内酯处理48 h。每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm波长的吸光度（A）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝A给药/A对照

2.1.3克隆形成实验检测细胞增殖取对数生长期的CAL27细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，细胞贴壁后更换为不同浓度（0、20、40、80μmol/L）的穿心莲内酯继续培养。48 h后更换为新鲜培养基，连续培养14 d，期间每2天更换新鲜培养基1次。细胞用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染液染色15 min，晾干后拍照并进行统计分析。

2.1.4流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的CAL27细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，细胞贴壁后更换为不同浓度（0、20、40、80μmol/L）的穿心莲内酯处理48 h，按照试剂盒说明书测定细胞凋亡情况。

2.1.5 脂质组学分析脂质组学检测委托苏州帕诺米克生物医药科技有限公司完成。

（1）样本收集：设置对照组和给药组，每组设置5个复孔。对照组给予完全培养基培养，给药组用40μmol/L穿心莲内酯处理48 h；弃去培养基后，用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入细胞裂解液刮取细胞，收集至1.5 mL离心管并于−80 ℃冻存备用。

（2）样本前处理：冻存样本中加入甲醇-氯仿混合液（2∶1），涡旋振荡30 s后4 ℃静置10 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取下层有机相，加入等体积预冷的正己烷，涡旋离心后取上清；上清液经氮吹仪干燥后，用异丙醇-甲醇-水混合液（2∶1∶1）复溶，经0.22μm有机滤膜滤过后，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪（UHPLC-Q Exactive HF-X）检测。

（3）色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；采用正、负离子双模式检测，正离子模式下的流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A1）-乙腈（B1），梯度洗脱：0～2.0 min，30% B1；2.0～10.0 min，30%～95% B1；10.0～13.0 min，95% B1；13.0～13.1 min，95%～30% B1；13.1～16.0 min，30% B1；负离子模式下的流动相为含5 mmol/L乙酸铵的水溶液（A2）-乙腈（B2），梯度洗脱程序同正离子模式。

（4）质谱条件：采用Q Exactive HF-X高分辨质谱仪，电喷雾电离源，正、负离子模式下进行全扫描检测；质谱扫描范围m/z100～1 500，一级分辨率70 000，二级分辨率17 500；正离子模式：喷雾电压3.2 kV，毛细管温度350 ℃，S-Lens RF 30%，鞘气流量40 arb，辅助气流量10 arb；负离子模式：喷雾电压2.8 kV，毛细管温度350℃，S-Lens RF 60%，鞘气流量40 arb，辅助气流量10 arb；碰撞能量设置为20、40、60 eV，用于脂质二级碎片离子检测。

2.1.6Western blotting检测NCOA4、p62和LC3B蛋白表达取对数生长期的CAL27细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，细胞贴壁后更换为不同浓度（0、20、40、80 μmol/L）的穿心莲内酯处理48 h。收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液在冰上裂解30 min，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭后，加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗，室温孵育1 h；加入ECL化学发光试剂显影，使用蛋白印迹成像系统拍照。

2.1.7 铁死亡抑制剂与穿心莲内酯联合处理对CAL27细胞存活及凋亡的影响设置对照组、Fer-1（0.5μmol/L）组、穿心莲内酯（40μmol/L）组和穿心莲内酯＋Fer-1组，加入相应药物处理48 h，对照组加入不含药物的培养基。按“2.1.2”项下方法检测细胞存活率，按“2.1.4”项下方法检测细胞凋亡率。

2.1.8 NCOA4降解剂与穿心莲内酯联合处理对CAL27细胞NCOA4、SLC7A11和GPX4蛋白表达的影响设置对照组、NCOA4降解剂（2 nmol/L）组、穿心莲内酯（40μmol/L）组和穿心莲内酯＋NCOA4降解剂组，加入相应药物处理48 h，对照组加入不含药物的培养基。按“2.1.6”项下方法检测相关蛋白表达。

2.2 动物实验

2.2.1造模、分组与给药本研究按照赫尔辛基宣言（2013年修订）进行，肿瘤样本取自1名接受舌癌手术切除的患者，获得患者的知情同意，并经浙江省肿瘤医院伦理委员会批准（批准号IRB-2020-1）。将肿瘤组织剪切成约10 mm3的组织小块，用套管针接种于裸鼠侧腹部。接种后每周观察裸鼠一般状况及成瘤情况，待肿瘤体积生长至100～150 mm3时，记为P1代。将初代成瘤组织剥离后按上述方法继续传代至P3代，视为患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型构建成功。采用P3代头颈鳞癌PDX模型裸鼠进行后续实验，保证肿瘤组织的生物学特性稳定。

P3代头颈鳞癌PDX模型裸鼠随机分为对照组和穿心莲内酯（10 mg/kg）组，每组4只。裸鼠分别ip生理盐水或穿心莲内酯，每3天1次，连续给药15 d。给药期间，每隔3 d称量裸鼠体质量，并用游标卡尺测量肿瘤长径和宽径，并计算肿瘤体积[肿瘤体积＝1/2(长径×宽径2)]。给药结束后，使用异氟烷对裸鼠实施安乐死，解剖取肿瘤组织，称定质量并拍照。

2.2.2 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肿瘤组织病理变化肿瘤组织经固定、脱水、包埋、切片后进行脱蜡复水，用苏木素染液染色细胞核，伊红染液染色胞质，脱水透明并用中性树胶封片，室温晾干后在显微镜下观察并拍照。

2.2.3 免疫组化检测肿瘤组织Ki67表达取肿瘤组织切片进行脱蜡复水、抗原修复，用过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶；5%牛血清白蛋白封闭后，孵育一抗和二抗，用DAB染色并复染封片，于显微镜下观察并拍照。

2.3 统计学分析

数据以表示，使用GraphPad Prism（9.5版）软件进行统计分析，两组比较采用t-test，多组比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 穿心莲内酯抑制CAL27细胞增殖并诱导其凋亡

如图1-A所示，不同浓度的穿心莲内酯处理CAL27细胞48 h后，细胞存活率呈剂量相关性降低，半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为86.01μmol/L，表明穿心莲内酯对CAL27细胞具有显著的增殖抑制作用，采用20、40、80 μmol/L穿心莲内酯进行后续研究。克隆形成实验结果（图1-B、D）显示，与对照组比较，穿心莲内酯各给药组细胞克隆形成数显著减少（P＜0.001），且克隆体积明显缩小，进一步证实穿心莲内酯能有效抑制CAL27细胞的克隆形成能力，降低其体外成瘤能力。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果见图1-C，对照组细胞自然凋亡率较低，穿心莲内酯（40、80 μmol/L）组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01、0.001），表明穿心莲内酯显著诱导CAL27细胞发生凋亡。以上结果表明穿心莲内酯能有效抑制CAL27细胞增殖并诱导其凋亡，且呈剂量相关性。

3.2 穿心莲内酯抑制小鼠体内头颈鳞癌肿瘤生长

如图2-A所示，患者来源原代头颈鳞癌肿瘤组织和PDX模型各代肿瘤组织病理结构高度相似，表明本研究成功构建了头颈鳞癌PDX模型，且该模型很好地保留了原代肿瘤的组织学特征。体内PDX模型实验结果（图2-B）显示，与对照组比较，穿心莲内酯组肿瘤增殖被显著抑制。肿瘤生长曲线结果（图2-C）表明，与对照组比较，穿心莲内酯组小鼠肿瘤体积增长速率显著减慢（P＜0.001）。连续治疗15 d后处死小鼠并剥离肿瘤组织，穿心莲内酯组肿瘤质量较对照组显著降低（P＜0.01，图2-D），且肿瘤质量与体质量的比值较对照组显著降低（P＜0.01，图2-G），表明穿心莲内酯在体内可显著抑制头颈鳞癌PDX模型肿瘤的生长。给药期间2组小鼠均无明显精神萎靡、摄食减少等异常状况，体质量无显著差异（图2-E），表明穿心莲内酯在实验剂量下对小鼠无明显毒性作用。免疫组化检测肿瘤组织Ki67蛋白表达，结果见图2-F，Ki67阳性信号定位于肿瘤细胞核，穿心莲内酯组肿瘤组织中Ki67蛋白阳性表达较对照组显著下调（P＜0.001），提示穿心莲内酯可通过抑制肿瘤细胞增殖活性发挥抗头颈鳞癌的作用。

3.3脂质组学分析结果

如图3-A～D所示，对照组和给药组共筛选出120种差异表达的脂质分子（P＜0.05）。利用热图（图3-E）和火山图（图3-F）对差异脂质分子进行可视化分析。同时，通过KEGG富集分析生成气泡图（图3-G）。在富集结果中，铁死亡通路和自噬通路为本研究关注的重点。脂质组学分析显示，穿心莲内酯可显著上调磷脂酰乙醇胺的表达水平。磷脂酰乙醇胺作为脂质过氧化的核心底物，其水平升高可驱动铁死亡的发生。上述结果提示，穿心莲内酯可能通过调控铁死亡、自噬相关通路分子发挥抗头颈鳞癌作用。

3.4 穿心莲内酯诱导CAL27细胞发生铁自噬

为明确铁死亡在穿心莲内酯抗头颈鳞癌过程中的作用，采用铁死亡特异性抑制剂Fer-1与穿心莲内酯联合处理CAL27细胞，如图4-A、B所示，与穿心莲内酯组比较，穿心莲内酯与Fer-1联合处理后细胞存活率显著升高（P＜0.001），细胞凋亡率显著降低（P＜0.001）。提示Fer-1可显著逆转穿心莲内酯的抑增殖、促凋亡效应，证实穿心莲内酯发挥抗头颈鳞癌作用依赖铁死亡通路。

结合脂质组学KEGG富集分析结果，推测穿心莲内酯抗头颈鳞癌可能与自噬依赖性铁死亡（即铁自噬）相关。铁自噬是一种选择性自噬过程，通过NCOA4介导铁蛋白降解，进而调控细胞内铁稳态[7]。铁蛋白是胞质内主要的铁储存蛋白，由2个亚基铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）和铁蛋白轻链（ferritin light chain，FTL）组成[5]。NCOA4作为铁蛋白降解的特异性货物受体，其介导的铁蛋白降解过程即为铁自噬，对维持铁稳态具有重要意义[6]。作为铁自噬的关键调控因子，NCOA4的表达水平显著影响铁自噬的活性。为探究穿心莲内酯对CAL27细胞铁自噬的调控作用，采用Western blotting检测不同浓度穿心莲内酯处理后的CAL27细胞中铁自噬相关蛋白的表达水平，结果见图4-C，与对照组比较，40、80 μmol/L穿心莲内酯处理后的细胞中铁自噬关键蛋白NCOA4和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达显著升高（P＜0.05、0.01），p62蛋白表达水平显著降低（P＜0.01、0.001），且呈剂量相关性，表明穿心莲内酯可显著激活CAL27细胞的铁自噬通路。

为了进一步明确NCOA4在穿心莲内酯诱导的铁自噬中的作用，使用NCOA4靶向降解剂（PROTAC NCOA4 degrader-1）选择性地抑制NCOA4的表达。PROTAC NCOA4 degrader-1是一种基于von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子（von Hippel-Lindau tumor suppressor，VHL）的NCOA4蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimera，PROTAC），可特异性靶向降解NCOA4蛋白[18]。如图4-D所示，与穿心莲内酯组比较，穿心莲内酯与NCOA4降解剂联合处理后细胞中NCOA4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），GPX4和SLC7A11蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。以上结果表明穿心莲内酯可以有效诱导CAL27细胞发生铁自噬，提示铁自噬通路的激活可能是穿心莲内酯发挥抗头颈鳞癌作用的重要分子机制。